El mundo a través del Microscopio II: Microscopía Confocal

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Microscopía Confocal, las imágenes fluorescentes




Imágen de una célula con estructuras específicas marcadas. Núcleo, mitocondrias y citoesqueleto.

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De la Microscopía Óptica a la Microscopía Confocal


Hoy les traigo un segmento microscópico nuevo, un tipo de microscopía que está muy difundida en al ciencia básica y también en la medicina; la Microscopía Confocal.

Previamente vimos el uso y manejo de un microscopio óptico (M.O.), es decir, un tipo de microscopia que funciona con una fuente de luz natural. Para ver colores en las muestras o preparados, debíamos colorear las muestras con tintes especiales o valernos de la refringencia de las estructura a observar. 

Para este tipo de microscopia se utilizan diferentes técnicas para el preparado de las muestras.



Breve resumen de la Técnica Histológica para el uso del Microscopio Óptico


Si deseamos ver un tejido específico, por ejemplo un corte de piel, debemos seguir una serie de pasos que van desde obtener una muestra y procesarla hasta ser apta para ser observada al microscopio.

A modo de resumen, los pasos de la técnica histológica incluyen:

Obtención de la muestra por biopsia o autopsia.

Fijación (es decir, agregar un reactivo a la muestra como el paraformaldehído, para provocar enlaces cruzados covalentes de las proteínas de las células, y de esta forma conservar la estructura lo mas parecida al tejido vivo y evitar que se pudra)

1.Deshidratación

2.Aclaración

3. Inclusión

4.Corte con micrótomo

5.Desparafinar

6.Rehidratar

7.Colorear con tintes específicos


Si,  muchos pasos...pero estos cortes bien preparados pueden durar para siempre, además han sido y son esenciales para los diagnósticos por parte de los patólogos de diferentes enfermedades, como detección e identificación de tumores, análisis de preparados ginecológicos, identificación de lesiones, etc. Un preparado más sencillo pero que también es útil y actual, es el frotis de sangre, donde una muestra de sangre, es fijada y coloreada para conteo de linfocitos, análisis de los glóbulos rojos, etc (Figura 1).







Preparación de una muestra histológica para ser observada al microscopio óptico.


Figura 1. La imagen de arriba muestra un micrótomo. La imagen de abajo un corte de tráquea coloreado y listo para ser observado al microscopio óptico.



También podemos ver tejidos vegetales que son bastante coloridos per se, por lo que si disponés incluso de un microscopio de juguete, podés aprovechar las moléculas que dan color a las hojas o pétalos y ver las células vegetales (Figura 2).




Figura 2. Las plantas nos proporcionan la posibilidad de ver sus tejidos coloreados debido a que poseen pigmentos propios.





   Pero volvamos al comienzo del artículo: el Microscopio Confocal.


A diferencia del M.O., este instrumento óptico es un arreglo de láseres de longitudes de onda específicos que impactarán sobre la muestra que previamente ha sido tratada con un fluoróforo. Esta molécula fluorescente se excitará producto del impacto del láser y emitirá una señal a una longitud de onda específica; lo que nos permitirá ver la estructura de la célula a la que este fluoróforo fue adherido.

La luz coherente emitida por el sistema láser (fuente de excitación) pasará a través de una abertura estenopeica, es decir sin lentes; es un orificio denominado pinhole en inglés que se  sitúa en un plano conjugado (confocal) con un punto de escaneo en la muestra y una segunda abertura estenopeica ubicada frente al detector (que es un tubo fotomultiplicador). A medida que el láser se refleja en un espejo dicromático y escanea la muestra en un plano focal definido, la fluorescencia secundaria emitida desde los puntos de la muestra (en el mismo plano focal) pasa de regreso a través del espejo dicromático y se enfoca como un punto confocal en la apertura del detector (Figura 3).





Esuqema detallado de un microscopio confocal.



Figura 3. Esquema del funcionamiento del microscopio confocal. Adaptado de www.olympus-lifescience.com.



Dado que solo una pequeña fracción de la emisión de fluorescencia desenfocada se transmite a través del pinhole, el fotomultiplicador no detecta la mayor parte de esta luz extraña y no contribuye a la imagen resultante.

El espejo dicromático, el filtro de barrera y el filtro de excitación realizan funciones similares a los de un microscopio de epifluorescencia de campo amplio; sin embargo, la ventaja del microscopio confocal es las imágenes resultan más nítidas (Figura 4). 


En la microscopía tradicional de epifluorescencia de campo amplio, toda la muestra se somete a una iluminación intensa de una lámpara de xenón o mercurio, y la imagen resultante de la emisión de fluorescencia secundaria puede verse directamente en los oculares o proyectarse sobre la superficie de un dispositivo electrónico. En contraste con este concepto simple, el mecanismo de formación de imágenes en un microscopio confocal es fundamentalmente diferente. Como se mencionó antes, el microscopio de fluorescencia confocal consta de múltiples fuentes de excitación láser, un cabezal de escaneo con componentes ópticos y electrónicos, detectores electrónicos (generalmente fotomultiplicadores) y una computadora para la adquisición, procesamiento, análisis y visualización de imágenes.




Estructuras intracelulares marcadas con fluoróforos vistas al microscopio confocal



Figura 4. La microscopía confocal permite ver con gran resolución estructuras intracelulares como el citoesqueleto.



🔍¿Cómo se preparan estas muestras para la microscopía confocal?🔬


A diferencia de la microscopía óptica mencionada, las muestras para microscopía confocal se preparan por ejemplo a partir de células en cultivo. Para ello, las células crecen sobre vidrios pequeños (cubreobjetos) que luego se retiran de la placa y pueden ser colocados sobre portaobjetos (Figura 5). 

Previamente, las muestras deben ser fijadas, permeabilizadas para permitir el ingreso de las moléculas marcadoras de las estructuras de interés, colocarlas sobre el portaobjetos, pegando el cubreobjeto al portaobjeto. Luego de todo este procedimiento, podemos llevarla al microscopio confocal.




las células crecen sobre vidrios pequeños (cubreobjetos) que luego se retiran de la placa y pueden ser colocados sobre portaobjetos


Figura 5. Preparación de muestras sobre portaobjetos para ser observadas al microscopio confocal.




Por lo tanto, la microscopía confocal al hacer uso de láseres, se basa en la fluorescencia. Es necesario entonces contar con moléculas fluorescentes que se marquen estructuras precisas de la muestra. 

De esta forma, solo esas partes marcadas de la muestra podrán ser vistas a través del microscopio. Estas moléculas marcadores se preparan a partir de proteínas (como anticuerpos) o ácidos nucleicos al los cuales se les adiciona un fluoróforo. 

Los anticuerpos se caracterizan por ser específicos de y reconoceran algunas estrcuturas, como el citoesqueleto. Otros marcadores son específicos del núcleo, intercalandose entre las bases del ADN, por lo que al mirar a través del microscopio confocal, veremos la fluorescencia que proviene exclusivamente de esta organela. 




🔍¿Cómo funciona la fluorescencia?🔬




Hasta ahora mencionamos muchas cosas...pero ¿qué es la fluorescencia?. Podemos definirla como un fenómeno físico que se caracteriza por un proceso de absorción de una radiación (de una fuente de luz discreta como un láser) que provoca que una molécula pase desde un estado de reposo o fundamental a un estado excitado. 

Cuando la molécula vuelve a su estado fundamental, puede transferir la energía de dos maneras:  o bien en forma de calor o bien emitiendo radiación a una mayor longitud de onda como fluorescencia. Esa es la radiación de emisión que vemos a través del microscopio. 

Por lo tanto, siempre que deseemos utilizar la microscopía confocal deberemos tener en cuenta que excitamos a una longitud de onda dada (que es la del láser del equipo). Esa energía discreta, excitará la molécula fluorescente que emitirá a una longitud de onda mayor que la de excitación. 

Por lo tanto, es necesario conocer  los espectros de excitación y emisión de las moléculas que usamos para marcar las muestras (Figura 6 y 7).





Si se irradia con una longitud de onda de 488 nm sobre una molécula excitable en ese espectro, ésta emitirá fluorescencia a una longitud de onda mayor a 488 nm (alrededor de un máximo de 550 nm).


Figura 6. Si se irradia con una longitud de onda de 488 nm sobre una molécula excitable en ese espectro, ésta emitirá fluorescencia a una longitud de onda mayor a 488 nm (alrededor de un máximo de 550 nm).





La energía de excitación proporcionada a una molécula en el estado fundamental, lo que provoca el salto de los fotones a un estado excitado simple, donde luego decaen a un nivel de energía vibracional más bajo. Esta energía se relaja hasta regresar al estado fundamental de la molécula, emitiendo fotones en el proceso, es decir fluorescencia.




Figura 7. Esquema que muestra la energía de excitación proporcionada a una molécula en el estado fundamental, lo que provoca el salto de los fotones a un estado excitado simple, donde luego decaen a un nivel de energía vibracional más bajo. Esta energía se relaja hasta regresar al estado fundamental de la molécula, emitiendo fotones en el proceso, es decir fluorescencia.




Como verán, el mundo de la microscopía es inmenso, muy bello e interesante...hoy en día estas técnicas y tecnologías permiten ver dentro de la célula, estudiar procesos y hasta explicar mecanismos de enfermedades.

!!Hasta la próxima!!👍👋👋



Referencias:



Soy Licenciada en Ciencias Biológicas y tengo un PhD en Química Biológica. Escribo esta página basada en mi experiencia como docente e investigadora y utilizo fuentes de información confiables para la redacción de los artículos:



Assessment of Human Pancreatic Islet Architectureand Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy

Confocal Microscopy






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